培養箱必須先經過清潔才能實現消毒和滅菌的目的，許多殺菌劑只對經過清潔過的物品才具有殺菌活性。清潔時必須使用與以后使用的消毒劑或殺菌劑化學性質上相容的試劑進行清潔、消毒。
①清潔箱體表面：先拂去表面的灰塵，再用濕的海綿或軟布清洗，再用軟布擦干。如果有污物則用低濃度的清潔劑清洗，然后擦干。
②清洗箱體內部：選擇合適的消毒劑。所有的物件和表面必須清洗，然后用無菌水沖洗，再擦干或晾干。
③清洗玻璃門：清洗箱內的玻璃門時使用的清潔劑和清洗培養箱內部時使用的相同。然后用蒸餾水漂洗，從而清除殘留的清潔劑，最后用軟布把門擦干。
二氧化碳培養箱的消毒和滅菌
消毒是指殺死微生物的物理或化學手段，但不一定殺死其孢子。滅菌是指殺死所有微生物，當培養箱內細胞受到污染時則需要采取滅菌措施。一般，在培養箱內細胞沒有污染的情況下平均1-3個月消毒一次。的3種消毒滅菌的方式是：液體消毒劑、紫外和加熱。
①液體消毒劑：選擇對培養箱無腐蝕性的液體消毒劑，并且液體消毒劑的消毒效果好壞和很多因素有關。比如：場所的溫度、接觸時間、pH、穿透能力、有機物的反應。這些因素中的一些很小的變化可能會造成去污劑的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情況下，當最終要求必須無菌時，液體去污劑也不是可信賴的去污方法。
②紫外消毒：一般先用蒸餾水清洗干凈后，再用培養箱自帶的紫外燈照射一天或者用手提式的紫外燈照射。因被遮擋時或距離遠時都會削弱紫外滅菌的效果，紫外滅菌方式較為簡單。
③加熱：濕熱和干熱被認為是殺菌的方法。在一般環境下，高壓滅菌器加熱到121℃快速產生蒸汽是的方法，但是二氧化碳培養箱無法進行高溫高壓滅菌，只能退而求其次進行90℃濕熱滅菌，但90℃因為溫度過低，起不到100℃以上水蒸汽所帶來的滲透性和高壓力效果，所以滅菌效果也大打折扣.而干熱140℃-180℃，可以起到滅菌的作用。
